1) RT (reverse transcriptase)-PCR Ampicor R HIV-1 Monitor vs. 1.5 (Roche),

2) NASBA (nucleic acid sequenze-based amplification) Nuclisens HIV-1 RNA QT (Organon, Biomeriuex)

3) b-DNA (branched DNA amplification) Versant HIV-RNA 3.0 (Bayer Co Chiron).

Si tratta di tre metodi ugualmente affidabili con un limite di sensibilità di 50 copie/ml i primi due e di 75 copie/ml il terzo. Esiste tuttavia una significativa variabilità tra i valori che si possono ottenere con i tre metodi; pertanto, è importante che il monitoraggio di ciascun paziente venga eseguito utilizzando sempre la stessa metodica.

Nei pazienti naive (AIII) o sottoposti ad un regime terapeutico stabilizzato (AII), la carica iniziale dovrebbe essere determinata ogni 3-6 mesi. Nei soggetti che iniziano la terapia la carica virale dovrebbe venire confermata con una ulteriore misurazione (BIII). Tuttavia, la conferma del dato può essere evitata in pazienti che si presentino con una infezione in stadio avanzato allo scopo di evitare pericolosi ritardi nell.inizio della terapia. La viremia dovrà essere ulteriormente misurata
dopo 2-8 settimane dopo l'inizio della terapia. In tale momento, se la terapia è efficace, normalmente si riscontra una riduzione pari a 1 Log10 rispetto al basale.
Successivamente, in corso di terapia attiva, la velocità del decremento viremico è rallentata ma continua fino alla
negativizzazione della carica virale (<50 - <75 copie di HIV RNA/ml) entro 16-24 settimane dall'inizio.
Il mancato raggiungimento di questa negativizzazione può suggerire l'opportunità di interventi sull'aderenza del paziente al trattamento, sulla valutazione dell.assorbimento farmacologico (biodisponibilità) o su un precoce cambio di terapia.
Poiché l'attivazione del sistema immune in risposta a qualsiasi infezione o stimolazione vaccinale può causare l'incremento della viremia, questa non dovrebbe venire misurata in corso di tali eventi o a distanza < 4 settimane.
Infine, è importante sottolineare come la variabilità naturale e biologica del test di viremia corrisponda a circa 0.5 Log10 per cui solo variazioni superiori a tale limite in misurazioni sequenziali sono da considerarsi significative.

La determinazione dei linfociti totali, dei linfociti con fenotipo CD3+, CD4+ e CD8+ ed il rapporto CD4+/CD8+ è essenziale per la stadiazione della malattia da HIV-1 e per la definizione di caso di sindrome da immunodeficienza acquisita. Inoltre la valutazione di queste cellule è importante per il follow-up delle persone con infezione da HIV-1, per decidere l.inizio della terapia antiretrovirale, per instaurare o sospendere la profilassi delle infezioni opportunistiche, per stabilire quando si è in presenza di una risposta immunologica positiva o di un fallimento immunologico, con le conseguenze di modificare o di mantenere la terapia iniziata.

La determinazione viene effettuata calcolando la percentuale delle cellule CD3+ (linfociti T totali), di quelle CD4+ definite come T helper e CD8+ (cytotossic-suppressor)) e confrontandola con quella delle persone adulte normali o dei bambini della stessa età.
Per quanto riguarda i valori assoluti delle sottopolazioni linfocitarie le linee guida internazionali dei CDC pubblicate nel 1997 consigliavano la metodica delle due determinazioni con distinti strumenti: un citofluorimentro ed un analizzatore per ematologia (CDC, 1997).
Con questa metodica la determinazione delle sottopopolazioni linfocitarie viene effettuata partendo dal numero totale dei linfociti e dalla percentuale dei linfociti con fenotipo CD3+, CD4+ o CD8+.

Follow-up immunologico delle persone con infezione da HIV-1 e in terapia antiretrovirale

La valutazione delle sottopopolazioni linfocitarie CD3+,CD4+,CD8+ viene raccomandata ogni 3 mesi.In persone con valori di CD4 in rapida diminuzione o con valori inferiori a 350/mL può essere utile ravvicinare l.intervallo delle determinazioni a due mesi o ad un mese.
Non esistono consensi unanimi sul significato di caduta rapida di linfociti CD4, di mancata risposta immunologica o scarso recupero immunologico.
Un criterio utile è quello di distingure le persone sulla base del conteggio iniziale di CD4 , di fare riferimento ad un periodo di tempo di tre mesi tra una prima e seconda determinazione dei CD4 , di effettuare il confronto in termini di percentuale di aumento o diminuzione dei CD4 rispetto al valore iniziale ed infine di ripetere l'analisi a più breve distanza di tempo in caso di risposte che presentano forti variazioni nel conteggio dei CD4, dei linfociti o dei globuli bianchi.

Nei soggetti con CD4 compresi tra 0 e 100 devono essere prese in considerazione variazioni + o -50 % del valore iniziale (es. un valore di CD4 iniziale di 50/mL che si incrementa a 75/mL può avere il significato di recupero immunologico.

Nelle persone con valori compresi tra 100 e 350 mL possono essere considerate variazioni significative quelle comprese entro il 30 % del valore iniziale (es. CD4 150 /mL :diminuzione o aumento a 100 o 200/mL).

Nei soggetti con valori superiori a 350 CD4/mL di base vanno prese in considerazioni oscillazioni con limiti inferiori compresi tra il 15 e 20 %.

Queste indicazioni sono soltanto indicative. Nel caso di forti oscillazioni in breve periodo di tempo, specie con valori elevati di CD4 è utile ripetere l'esame dopo poche settimane al fine di validare il precedente esame.
Oscillazioni del conteggio dei CD4 contenute nei limiti di queste percentuali permettono di concludere per una situazione di stabilità immunologica. Esiste una notevole variabilità individuale anche nei soggetti asintomatici sieronegativi. Inoltre oscillazioni di variabilità comprese tra il 2 % e il 5 % a seconda del valore assoluto dei linfociti e dei CD4 sono attribuibili all'esecuzione della stessa metodica, specie con la metodica in doppia piattaforma( Pandolfi et al.).

Scheda di approfondimento: tecniche di rilevazione della conta linfocitaria

Lo sviluppo di nuove linee guida consiste nelle seguenti indicazioni:

1) una strategia di gating che identifica i linfociti con fluorescenza per CD45 e side scattering ;
2) l.impiego di una citofluorometria a flusso con tre-quattro colori che è superiore a quella con due colori per la determinazione delle CD4+ e CD8+;
3) la disponibilità e l'uso di microfluorosfere approvate commercialmente dall' FDA per il metodo della rilevazione con
singola apparecchiatura (vedi dopo),Questa procedura è da preferire perchè riduce la variabilità intra- ed interlaboratorio(Reimann et al.).

Dal gennaio 2003 viene raccomandata dai CDC una nuova metodica basata sull' impiego di un solo strumento o singola piattaforma per la rilevazione dei linfociti (CDC, 2003).

I linfociti sono identificati con anticorpo monoclonale CD45.
I linfociti CD4+ sono identificati per la positività al CD3 ed al CD4 e quelli CD8+ per la positività a CD3 e CD8. E'
possibile la determinazione contemporanea con un pannello di tre-quattro anticorpi monoclonali aggiungendo nella
singola provetta i monoclonali CD45, CD3, CD4 e CD8 .
Nei bambini può essere utile l.impiego del monoclonale CD19 per la numerazione dei B linfociti.
L'uso di una seconda provetta contenente un marker per NK con CD3 e CD19 può essere di aiuto per la purezza dei
linfociti nel singolo side scatter gate.
Deve essere previsto almeno il conteggio di 2.500 linfociti gated in ogni campione al fine di assicurare un valore assoluto sicuro.
Per quanto riguarda la sicurezza del laboratorio, la raccolta dei campioni, la loro conservazione, l'esecuzione
dell'analisi entro le 48 ore max, l'uso dell.anticoagulante (K3 EDTA, 1.5+-015mg/mL di sangue) o l'eparina, il
trasporto dei campioni, la valutazione dei campioni trasportati, la processazione dei campioni, il pannello degli anticorpi
monoclonali, i controlli positivi e negativi e l.analisi dei risultati e la loro interpretazione si rimanda sempre alla
pubblicazione dei CDC del 2003.
Per quanto riguarda la variabilità intra ed interlaboratorio si ricorda che la stessa è più elevata quando il valore dei
linfociti CD4+ è > di 500/mL e si riduce con valori inferiori a 200/mL.
Altre raccomandazioni sono consultabili nel lavoro di Pandolfi che riporta le variabilità rilevate con il metodo delle due piattaforme in vari laboratori italiani e le possibilità di riduzione delle stesse.
Ai fini di un corretto monitoraggio immunologico e quindi anche clinico.terapeutico, tenendo presente l'obiettivo di
contenimento dei costi per analisi di laboratorio, è sufficiente eseguire le sottopolazioni linfocitarie ogni 3-4 mesi. In
persone sieropositive che hanno valori di CD4+ > di 500/mL e con una pregressa storia clinica ed immunologica stabile
e senza trattamento l'analisi può essere effettuata anche ogni sei mesi, tenendo presente che in media un soggetto senza
terapia subisce una caduta dei linfociti CD4+ di circa 80 cellule/mL ogni anno con oscillazioni +-20.
La decisione di effettuare solo la determinazione dei singoli CD3+ e CD4 + viene lasciata al clinico che terrà in considerazione l'insieme dei dati della persona e delle risorse disponibili.

Scheda di approfondimento: tecniche di rilevazione di altre sottopolazioni linfocitarie ed eventuali test per lo studio delle funzioni del sistema immunitarioai fini di ricerca

Vi sono situazioni cliniche particolari nelle quali può essere utile avere alcune informazioni sulla situazione di altre
sottopopolazioni linfocitarie.
Ad esempio soggetti che sono sottoposti a protocolli sperimentali con farmaci nuovi o con diverse combinazioni,
soggetti che presentano una grave situazione immunologica. In questi casi può essere utile conoscere la situazione delle cellule naive post-timiche o delle cellule memoria o dei marker di attivazione linfocitaria.
I marcatori di attivazione linfocitaria sono utili per conoscere se nel soggetto vi è una attivazione delle cellule
linfocitarie e quindi indirettamente avere informazioni sul controllo della replicazione del virus HIV-1 o di altre
infezioni . In questi casi è importante avere un controllo di base prima dell.inizio della terapia perché in genere questi
marcatori sono aumentati rispetto al soggetto asintomatico di controllo, diminuiscono con tendenza alla
normalizzazione in corso di terapia antivirale e possono subire un forte aumento in caso di fallimento immunologico
(Mezzaroma et al). Si raccomanda in questi casi la determinazione delle cellule CD4+HLADR+, CD8+HLADR+ o
delle cellule CD4+CD38+ o CD8+CD38+.
In alcune situazioni di grave depressione immunitaria si raccomanda la rilevazione anche delle cellule naive con
fenotipo CD4+ o CD8+ (CD4+/CD45RA+CD62L+ e CD8+/CD45RA+CD62L+). Inoltre, recentemente sono state
caratterizzate nel sangue periferico le cellule T CD4/CD45RA+CD31+ come cellule naive timiche (Kimming et al.)
parametro utile per la valutazione dell.output timico in citofluorimetria senza ricorrere ad altre metodiche immunologiche più costose.
La valutazione delle cellule memoria può essere fatta anche indirettamente rispetto alle cellule naive
(CD4+/CD45RA+CD62L- e CD4+/CD45RA-CD62L+) o valutando la co-espressione del marcatore CD45RO sulle
cellule CD4+ e CD8+). Un.assenza o forte riduzione di cellule memoria ha un significato prognostico sfavorevole,
mentre una scarsa produzione di cellule naive dopo l.inizio di terapia antivirale indica che probabilmente in queste
persone vi è un esaurimento del sistema immunitario e del timo. Questo può spiegare in alcune occasioni la
dissociazione immunovirologica dopo terapia (risposta virologica e non risposta immunologica).
Il monitoraggio delle cellule con fenotipo NK (CD3-CD16+CD56+) può essere utile nel caso in cui nel sangue
periferico vi sia un forte aumento di cellule non T.
L'enumerazione dei linfociti B con fenotipo CD19+ può essere effettuata in bambini ed adolescenti, ma presenta scarso valore in adulti, a meno di espansioni di cellule linfocitarie abnormi nel sangue periferico.
Non riteniamo di raccomandare altre metodiche immunologiche ancora non standardizzate e costose quali la rilevazione delle cellule post-timiche (TREC, T cell receptor exiscion circles)), la determinazione delle citochine
intracitoplasmatiche nelle cellule CD4+ o CD8+, la produzione di interleuchine, il fenotipo TH1 o TH2, lo studio dei
recettori per chemochine R5 o X4 nei linfociti T, lo studio del recettore dei linfociti T (regione v-beta ), la risposta
proliferativa T CD4 helper ad antigeni ubiquitari o a mitogeni. In alcune situazioni particolari ed in caso di eventuali
protocolli vaccinali si possono esaminare le risposte proliferative ad antigeni HIV-1 costituiti da proteine strutturali o
regolatorie o lo studio delle cellule citotossiche soppressorie con tetrameri, ma queste applicazioni devono essere
limitate a protocolli di ricerca.