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AGGIORNAMENTO DIAGNOSI E MONITORAGGIO INFEZIONE HIV

 
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MessaggioInviato: Mer Mag 19, 2010 5:20 pm    Oggetto: AGGIORNAMENTO DIAGNOSI E MONITORAGGIO INFEZIONE HIV Rispondi citando

Tratto da READ Files gennaio 2009
Pag31-34

Update dal Laboratorio

Inserto dedicato agli aggiornamenti in tema di diagnosi e monitoraggio dell’evoluzione dell’infezione da HIV e delle infezioni da virus epatitici,
con la quale rispondiamo ad una sempre maggior sentita esigenza di update su questi argomenti.
Per la diagnosi dell’infezione da HIV è oggi disponibile una serie di test di screening e di conferma, di cui le dottoresse Patrizia Bagnarelli, di Ancona, e Claudia Balotta, di Milano, presentano caratteristiche,
applicazioni, peculiarità.


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LA DIAGNOSI DI INFEZIONE DA HIV


GLI ANTICORPI (AC) DIRETTI CONTRO HIV SONO USUALMENTE PRESENTI A BASSO LIVELLO PRECOCEMENTE DOPO
L’INFEZIONE PRIMARIA: I SAGGI ELISA DI PRIMA GENERAZIONE ERANO IN GRADO DI EVIDENZIARLI SOLO A 6-12 SETTIMANE
(PERIODO FINESTRA).
I SAGGI SANDWICH DI TERZA GENERAZIONE RILEVANO GLI AC 3-4 SETTIMANE DOPO L’INFEZIONE E I SAGGI DI QUARTA GENERAZIONE IN TEMPI ANCORA PIÙ RAPIDI.

I TEST DI SCREENING, PER IDENTIFICARE HIV SU POPOLAZIONI POTENZIALMENTE ESPOSTE, PRESENTANO UN’ALTA SENSIBILITÀ (INTORNO 99%) OVVERO POCHI RISULTATI FALSI NEGATIVI MA COMPORTANO ALCUNI RISULTATI FALSI
POSITIVI, MENTRE PER I TEST DI CONFERMA È NECESSARIA UNA SPECIFICITÀ SUPERIORE AL 99%.

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TEST DI SCREENING
Saggi ELISA
Identificano: AC diretti contro HIV mediante enzimi coniugati che si legano ad essi e substrati o cromogeni che generano colore in una reazione catalizzata dagli enzimi.

Saggi di prima e seconda generazione: metodi indiretti nei quali si ha uno sviluppo di colore, misurato come densità ottica (OD) mediante spettrofotometro, proporzionale alla concentrazione degli AC nel campione.
I campioni con un rapporto tra l’OD del campione e OD di controlli superiori a 1.0 vengono definiti reattivi.
Diversi ELISA indiretti contengono sia coniugati anti-Ig G sia anti-Ig M per essere in grado di identificare precocemente l’infezione.

Saggi di terza generazione (metodi sandwich) : gli AC eventualmente presenti nel campione vengono ‘racchiusi’ tra l’AG
adeso al pozzetto e l’AG legato all’enzima. Hanno elevatissima sensibilità e sono utilizzati nello screening, in quanto hanno la capacità di rilevare tutti gli isotipi degli AC (sia Ig G, sia Ig M).

Saggi di quarta generazione: identificano AC anti-HIV, l’AG virale (la proteina p24 del gene gag) contemporaneamente;
hanno elevata sensibilità analitica ed elevata sensibilità epidemiologica (riduzione tempo di diagnosi a 3-4 settimane).

Applicazioni: nello screening dei donatori e nella diagnosi dell’infezione primaria in soggetti ad alto rischio e nei pazienti con infezione cronica che possono necessitare del trattamento antiretrovirale

Test rapidi (risultati in meno di ‘30 minuti)
Accuratezza comparabile ai saggi ELISA.

Applicazioni: per guidare le condotte mediche o stabilire immediatamente terapia e/o profilassi (Pronto Soccorso degli ospedali, sale parto, sale autoptiche, studi medici, piccole banche del sangue). Di particolare utilità nei paesi a risorse limitate, per semplice esecuzione e indipendenza da strumenti costosi e complessi.

Saggi ‘dot blot’ o ‘immunoblot’ incorporano controlli dell’esecuzione corretta del saggio; in caso di risultato positivo, determinano
la formazione di una ‘macchia’ su un supporto solido; permettono l’identificazione sia di HIV-1, sia di HIV-2.

Nuovi saggi cromatografici consistono in piccole cartucce piatte di plastica o di carta dove il sangue intero, la ‘saliva’ o il siero vengono fatti defluire rapidi (a flusso laterale) su una fase solida impregnata di reagente (proteina A su oro colloidale) che lega e permette la visualizzazione degli AC. Alcuni saggi impiegano la tecnologia a sandwich.

Vantaggi: forniscono i risultati in 10’ (alcuni in 2’) senza l’aggiunta di reagenti e incorporano i controlli per escludere errori tecnici. Alcuni test possono essere conservati a temperatura ambiente e sono facilmente trasportabili. I saggi su goccia di sangue ottenuta da un dito non comportano né prelievo, né conservazione o eliminazione dei campioni.
Alta flessibilità: saggiano ‘saliva’, plasma, sangue intero e gocce di sangue da dito.
Svantaggi: alto costo.


Test semplici
Richiedono più di 30’ ma non necessitano di strumenti e strutture complessi. I saggi di agglutinazione devono essere condotti in condizioni controllate di temperatura: particelle (globuli rossi, lattice, gelatina) ricoperte di AG vengono fatti reagire con gli AC sierici con formazione di aggregati se positivi. Essi incorporano controlli positivi.

TEST DI CONFERMA
Western Blot (WB)
Considerato la procedura gold standard, è una tecnica per il riconoscimento di anticorpi specifici che si legano a strisce di nitrocellulosa sulla quale sono fissati gli AG di HIV ottenuti da un lisato di una coltura virale.
La positività per HIV è caratterizzata da un pattern di bande.

Risultato positivo: almeno 2 tra le seguenti bande: p 24, gp 41, gp
120/160 (criteri del CDC).

Risultati indeterminati: 1 banda specifica oppure 1 o più bande diverse
da quelle indicate sopra (p 15, p 17, p 31, p 51, p 55, e p 66 - in quanto
esse potrebbero essere l’espressione del riconoscimento aspecifico
di anticorpi umani diretti contro proteine dell’ospite): riguardano circa
il 15% dei soggetti non infetti che hanno pattern di deboli reattività per
proteine simili a quelle codificate dal gene gag (principalmente p 17, p
24 e/o p 55).
Illustrazione che mostra i possibili profili di un risultato di WB a pag 32 del seguente documento pdf:
http://www.readfiles.it/_new/download/ReAd_files_1_2009.pdf

Alcuni soggetti con risultati indeterminati (basati essenzialmente sulla
presenza di p 24 e/o p 55) possono successivamente sieroconvertire
e ciò indica che queste bande sono ‘marcatori precoci’: in altri casi lo
stesso profilo non evolve nel tempo e non prelude a una sieroconversione.
Per questa ragione questi risultati vanno ripetuti su un nuovo
campione dopo un intervallo di almeno 2 settimane (ma preferibilmente
a 4-8 settimane) ripetendo il saggio anche sul primo prelievo con lo stesso kit per comparare i risultati.

Esistono soggetti con risultati indeterminati che persistono nel tempo
per ragioni non note (anticorpi cross-reattivi non specifici, ipergammaglobulinemia, malattie autoimmuni quali il lupus eritematoso sistemico, infezione con HIV-2 o retrovirus non noti).
Alcuni profili indeterminati (p 24, p 31 e p 55) sono più suggestivi di altri (sola p 17); la loro presenza in individui ad ‘alto rischio’ deve indurre alla monitorizzazione del soggetto con risultati indeterminati.

I soggetti con AIDS possono perdere reattività sia in WB sia in ELISA; in questi casi occorre ricorrere alla valutazione degli acidi nucleici virali.

WB modificati
Incorporano un peptide sintetico per identificare le bande specifiche per HIV-2 (gp 36). I criteri per l’identificazione di HIV-1 sono gli stessi indicati sopra, mentre per HIV-2 è necessaria la reazione con un AG specifico (p 36).

Immunofluorescenza indiretta (IFA)
Rileva, mediante microscopio a fluorescenza, gli AC anti-HIV su vetrino sul quale sono fissati linfociti infettati fatti reagire con il siero in esame, dopo l’aggiunta di AC fluorescinati.
E’ in grado di risolvere i dubbi di un WB indeterminato ma richiede la disponibilità di un microscopio ed esperienza nella lettura.

Line immunoassay (LIA)
Dall’accuratezza comparabile al WB standard, impiega AG virali sintetici o ricombinanti fissati su nitrocellulosa; la procedura è simile a quella del WB.

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SAGGI PER HIV-2

HIV-2, endemico nell’Africa Occidentale, si è diffuso a bassa prevalenza in Europa e necessita di essere diagnosticato in caso di sospetto clinico od epidemiologico.
HIV-1 ha un’omologia intorno al 60% e 30-40% rispettivamente per i geni strutturali gag, pol ed env da una parte e a gli altri geni accessori dall’altra.
Di conseguenza, gli AG e i pesi molecolari delle proteine codificate da questi geni variano così come la loro denominazione: p 56, p 26 e p 16 per le proteine Gag, p 68, p 34 per Pol e gp 36 o gp 41, gp 140 e gp 105 per Env. Sono disponibili per la diagnosi specifica saggi ELISA, saggi rapidi e saggi semplici.

I pazienti con infezione da HIV-2 potrebbero risultare negativi se testati con un ELISA per HIV-1 e il WB potrebbe mostrare una reattività crociata.

Entrambi i virus vengono oggi identificati mediante gli ELISA combinati HIV-1/2 che hanno una sensibilità equivalente a quelli singoli.

La differenziazione tra HIV-1 e HIV-2 deve essere fatta con ELISA
altamente specifici (basati su peptidi sintetici), WB specifico o RIPA o PCR (Polimerase Chain Reaction).

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STRATEGIE ALTERNATIVE DI SCREENING

Hanno semplificato l’esecuzione del prelievo e dei saggi e l’interpretazione dei risultati.

Test sulla saliva: è un saggio rapido che rileva gli AC del trasudato gengivale, presenti alla concentrazione di circa 1:400 rispetto al plasma, con controlli inclusi e sensibilità e specificità pari ad un ELISA.

Test sulle urine: la quantità di AC nelle urine ne permette il rilevamento sia in ELISA sia in WB. Lo sviluppo di saggi rapidi per le urine ha finora incontrato numerose difficoltà in quanto il pH urinario influenza
il legame AG/AC; inoltre, la bassa viscosità delle urine comporta un flusso troppo rapido nelle cartucce che influenza negativamente la corretta reazione AC/AG.

Test di screening eseguiti a domicilio: non sono ad oggi raccomandati per l’inadeguatezza delle procedure, la gestione critica ed il counselling dei risultati positivi. La Food and Drug Administration ha approvato solo la raccolta a domicilio del sangue su carta da filtro che, successivamente, deve essere ‘processata’ (attraverso eluizione ed
ELISA) da laboratori ad hoc e sta considerando la raccolta a domicilio del trasudato gengivale.

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STRATEGIE ALTERNATIVE DI CONFERMA

Meno costose, non richiedono strumentazioni complesse e appositi laboratori; messe a punto nei paesi a limitate risorse

L’uso in tandem di 2 saggi di screening può comportare un risparmio dell’80% dei costi. Il saggio a maggior sensibilità (ELISA, test rapido, test semplice) deve essere impiegato per primo.
Il primo e il secondo saggio devono essere diversi (biglie che legano gli AC anti-HIV in soluzione vs piastra con AC adesi al pozzetto) oppure devono utilizzare una fonte diversa di AG (lisato vs peptidi sintetici o ricombinanti).
Il nuovo saggio rapido di conferma analogo a saggi rapidi a flusso laterale ha fornito risultati eccellenti.

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DILEMMI DIAGNOSTICI

Risulti indeterminati in WB devono essere ripetuti in parallelo alla esecuzione di un nuovo WB a 1-3 mesi.
Se al tempo del primo test era in corso una sieroconversione verranno evidenziate nuove bande e bande, che si presentavano come al limite della reattività, diventeranno evidenti.
Alternativamente, per confermare un risultato positivo in ELISA, si può eseguire un’IFA, una PCR, un isolamento virale attraverso coltivazione delle cellule mononucleate di sangue periferico (PBMC) del paziente e di un donatore sano, o un saggio per la ricerca di antigeni virali.

I risultati di un WB al limite della reattività hanno solitamente il significato di una sieroconversione in atto che deve essere monitorizzata nel tempo.

Risultati incongruenti in WB, ovvero risultati negativi e positivi sullo stesso campione, al di fuori nel periodo finestra, sono il risultato di errori tecnici, errata marcatura del campione, uso di sistemi diversi non equivalenti o problemi di reagenti.

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RISULTATI FALSI NEGATIVI PER IL GRUPPO 0 DI HIV-1

Tutti i sottotipi e i sotto-sottotipi di HIV-1 (9 sottotipi puri: A, B, C, D, F, G, H, K, J e 5 sotto-sottotipi A1, A2, A3, A4, F1, F2), le 43 Forme Circolanti Ricombinanti (Circulating Recombinant Forms, CRF) riconosciute ad oggi e le Forme Ricombinanti Uniche (Unique Recombinant Forms, URF), di cui è impossibile valutare le proporzioni epidemiche, vengono riconosciuti dagli ELISA correntemente in uso.
Al contrario, i virus del Gruppo O (outlayer), che insieme al M (major) e
N (non M, non O) costituiscono il tipo 1 di HIV, secondo studi condotti in Camerun e Gabon (dove prevalentemente circolano) nel 20% dei casi non sono rilevati dai saggi ELISA standard. Sono in preparazione
kit commerciali che incorporeranno gli AG virali del Gruppo O.

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DIAGNOSI NEL NEONATO

Fino a 12-18 mesi di vita i bambini di madri HIV-positive presentano AC anti-HIV rilevabili in ELISA e WB, ma non diagnostici dell’avvenuta infezione.
La presenza di anticorpi anti HIV solo oltre i 18 mesi, pertanto, è segno altamente probabile di infezione.
La diagnosi precoce si basa sulla ricerca degli acidi nucleici virali nei PBMC (DNA-PCR), con prelievo eseguito entro 48 ore dalla nascita, ripetuto poi ad 1-2 mesi, quindi tra i 3 e i 6 mesi. Condotta in ambienti controllati per escludere la contaminazione di acidi nucleici e da personale esperto, la PCR è altamente sensibile (pochi sono i falsi negativi, già ad 1 mese di vita) e specifica (sono rarissimi i falsi positivi).

In caso di positività. il test va eseguito di nuovo per la conferma: 2 test PCR per DNA positivi indicano che il bambino ha contratto l’infezione. Viceversa, l'infezione può essere esclusa quando 2 test eseguiti entro il primo mese di vita con PCR per DNA risultano negativi e la negatività viene confermata da almeno un altro test eseguito dopo i 4 mesi
di vita.
La ricerca degli anticorpi in ELISA, sia per escludere, sia per confermare l’infezione, dovrà essere effettuata ad un'età compresa tra i quindici e i diciotto mesi.

Fonte: http://www.readfiles.it/_new/download/ReAd_files_1_2009.pdf
Pubblicato grazie alla segnalazione della Dott. Patrizia Ortolani
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